掌握DNA印跡技術的基本原理，學習DNA印跡技術的操作方法，了解DNA印跡技術的應用范圍。

【實驗原理】

DNA印跡是1975年由英國Southern創建的。其基本原理是：DNA分子經限制性核酸內切酶酶切后，由瓊脂糖凝膠電泳將所得DNA片段按分子質量大小分離，然后將DNA片段變性，并使凝膠中的單鏈DNA片段轉移到尼龍膜、硝酸纖維素膜(NC)或其他固相支持物上，此法中DNA片段由液流攜帶通過虹吸作用由下向上抽吸，從凝膠轉移印至濾膜表面。然后與相對應結構的已標記的探針進行雜交反應，用放射性自顯影或酶反應顯色來鑒定待測DNA分子。

DNA印跡技術主要用于對基因組DNA的定性和定量分析、克隆基因的酶切圖譜分析、基因突變分析及限制性片段長度多態性(RFLP)等。

【實驗對象】

待測DNA。

【試劑與器材】

(1) 水平電泳裝置，電泳儀，紫外燈，搖床。

(2)待測DNA，瓊脂糖，溴化乙啶，DNA探針，保鮮膜，緩沖液。

(3) 0.25 mol/L HCl

(4) 變性液：1.5 mol/L NaCl; 0.5 mol/L NaOH(保存于室溫)。

(5) 中和液： (pH 7.0) 5 mol/L NaCl; 0.5 mol/LTris-HCI (保存于室溫)。

(6) 轉移液 (20×SSC pH 7.0)：用800 ml H2O溶解175.3 gNaCl和88.2 g檸檬酸鈉，以濃 HCI調pH至7.0，用雙蒸水定容至1 L。分裝后高壓**。

(7) 2×SSC。

(8) 尼龍膜或硝酸纖維素 (NC) 膜。

【實驗方法與步驟】

(1) 取適量已酶切充分的待測DNA (1 μg左右)，于0.8%~1.25％的瓊脂糖凝膠上與合適的 DNA分子量標準一同進行穩壓電泳。

(2) 切去凝膠一角以標記方向，用溴化乙啶染色后拍照記錄電泳結果(拍照時，凝膠旁放一尺子，便于以后對照電泳帶在膜上的位置) ，再切下一側DNA分子量標準帶。

(3) 處理凝膠以備轉膜。

1) 蒸餾水短暫漂洗凝膠(輕搖)。

2) 將凝膠浸沒入10倍于凝膠體積(約30min)的0.25mol/LHCl溶液中15~30min，使DNA脫嘌呤。蒸餾水短暫漂洗凝膠2次。

3)將凝膠浸沒入10倍體積的變性液中20min，2次，蒸餾水漂洗2次。

4) 將凝膠浸沒入10倍體積的中和液中20min，2次，使變性液被中和。

(4) 在制備雜交用膠時準備轉移的平臺、膜、濾紙等。

(5) 安裝虹吸轉移裝置：如圖25-3所示，將一固體支持物置于盛有足以浸沒其一半高度的20×SSC的平皿中，依次將1張Whatman 3 mm濾紙橋，3張Whatman 3 mm濾紙，凝膠，疊放于固體支持物上，用塑料薄膜包裹凝膠邊緣后，將1張在蒸餾水中平衡過的尼龍膜(或用蒸餾水浸濕，然后在20×SSC中平衡10min的NC膜)，5張Whatman3mm濾紙及一疊4cm紙巾塔依次置于凝膠的上部，再放一玻璃板，其上壓重物(注意：凝膠與轉印膜間應避免有氣泡，濾紙、吸水紙巾等必須大小一致)。轉移持續4h以上或過夜，勿使轉移液干枯。

(6)使已轉移的DNA與膜交聯：取出轉印膜，用鉛筆在膜上標記樣品孔的位置，并切去一角以標示方向。用2×SSC漂洗轉印膜，然后將其放在一張Whatman3mm濾紙上，有DNA的一面朝上，使其完全干燥。再將膜置于UVcrosslinker中，在紫外光下自動交聯或將NC轉印膜置于可透過紫外線的塑料夾層中，帶有DNA的一面朝下，置于紫外透射儀(波長在254nm)上，以合適的照射強度進行紫外線交聯，以固定DNA。

(7) 用蒸餾水短暫的漂洗已交聯的膜后，將其夾于2張Whatman 3mm濾紙之間，80℃真空干烤2h或空氣干燥。轉印膜干燥后可夾在2張Whatman3mm濾紙之間，室溫下放置數月。備做核酸雜交實驗。

SouthernBlot僅僅是將待測DNA片段從電泳凝膠中轉移并固定到固相支持物上，要實現DNA探測還需完成核酸雜交實驗（包括探針標記、雜交和檢測三個后續實驗步驟）。雜交的雙方是待測核酸序列和探針，二者按堿基互補原則退火形成雙鏈。探針是用于檢測的已知核酸片段，根據標記物的不同可分為放射性(同位素)標記探針和非放射性(非同位素)標記探針。放射性標記的探針，是在探針制備過程中摻入32P-dNTP而實現放射性標記的。非同位素標記物有生物素(biotin)、地高辛(dig-oxigenin，Dig)和熒光素(Fluorescein)等。待測核酸與探針雜交后，通過放射自顯影、化學顯色或直接在(熒光)顯微鏡下觀察雜交信號來鑒定待測核酸分子的大小及含量(方法見第六節后附錄一和附錄二)。

【注意事項】

(1)在分辨核酸電泳帶所需的凝膠濃度范圍內，電泳中使用的瓊脂糖凝膠的濃度越低越好，并且厚度應 ≤7mm。轉印前切去凝膠多余的邊緣，因為凝膠邊緣多比凝膠本身要厚，與濾膜很難緊密相貼。

(2)電泳結束后，應在紫外檢測儀下仔細觀察酶切是否完全、電泳分離效果是否良好、DNA樣品有無降解、樣品量是否一致、是否有因電場強度不均勻導致樣品帶泳動速度不一致等。

(3)戴手套以防手受酸堿溶液損傷，同時避免污染濾膜。取拿濾膜時使用平頭鑷子。

(4)在轉移過程中，如吸水紙巾全部潤濕需及時更換，否則會造成緩沖液的逆流。

(5) DNA片段的大小決定其轉移速度。小于1kb的DNA片段，1h即可完成轉移過程。大片段DNA的轉移速度和效率則慢得多，如大于15kb的DNA片段需要18h以上。因此，當DNA片段長度大于15kb時需進行脫嘌呤(稀鹽酸)及強堿水解處理，使之降解成較小的片段，從而提高轉移效率。