探索超濾技術和澄清劑對綠茶澄清效果的影響

　　綠茶飲料含有蛋白質、茶多酚、游離氨基酸、***、淀粉、多糖及果膠等，呈現內在的不穩定膠體特性，當茶湯置于4℃的環境下，茶湯組分之間聯接系數增大，逐漸顯現為不溶性絮狀物，從而導致茶湯澄清度的變化，即改變茶湯光散射特性，這種現象稱為“茶乳酪”或 “冷渾濁”。渾濁形成的驅動力為貯藏過程中單聚合或二聚合多酚橋聯多個蛋白質形成大粒徑的膠體顆粒，可以通過濁度儀或者目測觀察到這種現象。
　　茶乳酪的形成不僅影響了產品的表觀形態，給消費者一種產品變質的印象，同時也影響了茶湯的滋味及顏色。這些感官特性的變化都與茶乳酪的形成有關。大多數相關研究主要集中于紅茶中茶乳酪的形成，對于綠茶的研究較少。市售茶飲料不僅應符合法規規定的品質要求，同時需考慮香氣、營養和渾濁程度。天然綠茶飲料的制備方法應該在保持營養成分的同時增加低溫的貯藏穩定性。

　　茶乳酪中的主要成分為茶多酚、***和蛋白質，其通過氫鍵和疏水作用力相結合，這些非共價作用力，在初始階段被認為是可逆的。盡管茶乳酪中同樣含有大量的碳水化合物，但其并沒有參與茶乳酪的形成機制中，而只是單純吸附于蛋白質和茶多酚的聚合物中。當溫度降低時，體系的總能量下降，引起大量膠體顆粒沉淀或因溶解度降低而析出。

　　現已有大量關于提高該體系穩定性的研究，如添加酶（木瓜蛋白酶、酸性脯氨酸水解酶、單寧酶）、吸附劑（硅藻土、硅膠、殼聚糖、明膠、聚乙烯吡咯烷酮）、包埋劑（β-環糊精）和采用UF, 技術及低溫貯藏處理。

　　UF 利用其特殊通道排除大分子及化學試劑，已廣泛應用于果汁和啤酒的澄清及濃縮。

　　硅膠、殼聚糖由于能絮凝和聚合負電荷物質及與蛋白質的肽鍵組分形成氫鍵，也被用于澄清果蔬汁和啤酒[20, 21, 22]。但上述方法對于茶飲料的澄清，則鮮有文獻涉及。本研究的主要目的是利用UF、硅膠及殼聚糖澄清茶湯，并研究其對茶湯質量和貯藏穩定性的影響。

　　1 材料和方法
　　殼聚糖（脫乙酰度95%，100 kDa）購于浙江奧星生物技術有限公司，硅膠（Silica 10）由中比啤酒有限公司提供，纖維素超濾膜（10 kDa、30 kDa、50 kDa 和100 kDa）購于上海摩速儀器有限公司，高速冷凍離心機（GL-20.B，上海安科有限公司），紫外可見分光光度計（UV-1600，上海美普達儀器有限公司），WSC-S 測**差計（上海精密科學儀器有限公司），安捷倫液相色譜儀1100，綠茶（念奴嬌，無錫）購于無錫家樂福超市。

　　1.1 綠茶茶湯的制備
　　將茶葉粉碎并過40-80 目篩。取茶粉2 g 置于200 mL 新煮沸去離子水中[23]（pH 6），于60℃水浴浸提20 min，利用脫脂棉進行粗過濾，并通過冰浴快速降溫，*后離心15 min（3000 r/min）。每次吸附或超濾試驗應使用同一批次、同一季節的茶葉以盡量減少實驗誤差。

　　1.2 澄清處理
　　進行超濾實驗時，預先用0.01%（w/v）NaOH 溶液浸泡超濾膜30 min 以除去超濾膜上的污垢。將綠茶茶湯轉移到超濾杯中，于壓力0.18 Mpa 下，用磁力攪拌進行超濾，這為超濾提供驅動力和提高超濾膜的通透性[26]。利用不同截留分子量的超濾膜進行茶湯超濾，以確定截留分子量對茶湯特性及膜通量的影響。超濾過程中每30 min 測定超濾過的體積以計算不同截留分子量超濾膜的膜通量（L/h·m2）[27]。超濾結束后，測定茶湯中茶多酚、游離氨基酸、蛋白質含量及濁度。

　　殼聚糖（0.04 g）溶于5%檸檬酸溶液，并添加于100 mL 綠茶茶湯中，利用NaOH 和檸檬酸溶液將茶湯pH 調至4-6，并攪拌30 min；將0.03%-0.08%（w/v）殼聚糖添加到綠茶茶湯中（pH 5.5）；添加有0.04%殼聚糖的茶湯（pH 5.5）攪拌不同的時間范圍：20-60 min。

　　處理后的茶湯利用高速冷凍離心機除去絮凝物（8000 r/min, 20 min）。

　　添加硅膠（0.05 g）于100 mL 綠茶茶湯中，調pH 2-4，并攪拌30 min；將0.01%-0.15%（w/v）殼聚糖添加于綠茶茶湯中（pH 3）；添加有0.05%殼聚糖的茶湯（pH 5.5）攪拌不同的時間范圍：20-60 min。處理后茶湯利用高速冷凍離心機除去硅膠（8000 r/min, 20 min）。

　　1.3 綠茶茶湯成分測定
　　1.3.1 茶多酚測定茶湯中茶多酚含量利用酒石酸亞鐵顯色法在540 nm 測定吸光度[23]，利用下式計算：

　　TP (mg/100 mL) =A×1.957×2×100。

　　1.3.2 游離氨基酸含量測定綠茶茶湯中游離氨基酸含量采用茚三酮法測定[23]，利用谷氨酸作標準曲線：C (mg/100mL) = 0.3603×A + 0.1197 (R2 = 0.9947)。

　　1.3.3 蛋白質含量測定蛋白質含量利用考馬斯亮藍G-250 法測定[23]，利用牛血清白蛋白作標準曲線：C (mg/100mL) = 128.19×A - 7.0112 (R2 = 0.9984)。

　　1.3.4 綠茶茶湯濁度測定綠茶茶湯濁度在640 nm 處利用分光光度計測定，去離子水作空白溶液。

　　1.3.5 色澤測定澄清處理前后綠茶茶湯的色澤利用Hunter 參數進行評價[28]，去離子水為空白?！鱈（亮度）, △a（紅-綠）, △b（黃-藍）及 △E（總色差）?！鱈 越小越透亮；△a 正為紅，負為綠；△b 正為黃，負為藍。

　　1.3.6 氨基酸分析儀器：安捷倫液相色譜儀1100；色譜柱：ODS Hypersil，250*4.6 mm；柱溫：40℃；流動相：20 mmol 醋酸鈉溶液，甲醇:乙腈=1:2（V/V）；檢測器：UV 338 nm；流速：1.0 mL/min。

　　2 結果和討論
　　2.1 超濾處理試驗
　　由于超濾過程膜上壓力一定，對膜表面茶湯具有濃縮效應，因此可以通過膜通量的公式：

　　△V/△t·S 計算不同截留分子量超濾膜的膜通量變化。為膜通量-時間曲線，截留分子量為100 kDa、50 kDa、30 kDa 超濾膜在超濾初始階段表現相對大的滲透性，膜通量分別為31.60L/m2·h、30.30 L/m2·h 和25.34 L/m2·h。由于綠茶茶湯中大分子組分和顆粒截留于膜表面形成污垢，導致膜滲透性顯著降低。隨著時間增加，膜通量趨于穩定。然而截留分子量為10 kDa超濾膜的膜通量在初始階段為13.22 L/m2·h，為其它三種膜的一半，并且隨著時間的延長，變化較小。這表明綠茶茶湯中大分子組分的分子量大于10 kDa，因此在超濾初始階段，這些大分子物質即在膜表面形成污垢，導致初始膜通量很小。這些由膜通量得到的關于茶湯組分分子量的結果與茶湯組分測定結果相對應。截留分子量大的超濾膜超濾茶湯后，其濁度相對較高，顏色較深，這與蘋果汁超濾的研究結果相一致。但是如果膜截留分子量太小，一些色素如葉綠素、茶黃素并不能通過超濾膜，綠茶茶湯顏色將較淡。

　　綠茶茶湯經超濾后，主要成分含量隨著截留分子量改變而顯著改變。茶多酚含量從115.46 mg/100 mL 降至103.72 mg/100 mL，蛋白質含量從11.36 mg/100 mL 降低到5.85mg/100 mL。這表明大多數蛋白質或蛋白質與茶多酚的聚合物分子量大于10 kDa，而被阻隔于膜表面。茶多酚和游離氨基酸含量也同時降低，這可能是部分茶多酚和氨基酸與蛋白質之間存在作用力。因此可以推斷超濾過程中污垢的主要組分為蛋白質及茶多酚。

　　蛋白質、茶多酚、游離氨基酸和多糖等被截留于膜表面，降低了可溶性固形物含量。膜截留分子量和游離氨基酸顯著相關，表明截留分子量對于綠茶茶湯滋味影響很大，同時綠茶茶湯中大多數組分為負電物質，其不可逆吸附于膜表面也易形成污垢。因此綠茶飲料的質量與超濾膜的截留分子量相關。

　　綠茶茶湯超濾的截留分子量*適為30 kDa，但是普通超濾效率太低，并且受制于經濟因素及對茶湯感官品質的影響，限制了其在天然綠茶飲料制備中的應用。目前有文獻報道一些新型技術可在一定程度上解決上述問題：反洗技術或低溫超濾能減少污垢的形成速度，提高膜通量；利用預蒸發法收集綠茶茶湯加工過程中損失的風味，并重新加入至超濾澄清后的綠茶茶湯中以恢復茶湯風味。

　　2.2 殼聚糖處理
　　殼聚糖（脫乙酰幾丁質，聚β-（1-4）N -乙酰氨基葡萄糖）是幾丁質通過堿處理的聚電荷多糖，也是**具有正電荷的多糖。殼聚糖作為**大有機化合物，加之其低毒、生物可降解，可應用于農業、化學、醫藥、化妝品、食品、紡織和廢水處理行業中作為增稠、絮凝、吸附、澄清、包衣、及賦形劑，并已廣泛應用于果汁和飲料的澄清。殼聚糖能絮凝綠茶茶湯中具負電荷的組分，如果膠、蛋白質等，并能選擇性地螯合金屬離子，實現與飲料中懸浮物質的分離。金屬離子也能參與綠茶茶乳酪的形成，而殼聚糖碳鏈上的–NH2 基團與金屬離子具有特殊的螯合作用。殼聚糖的脫乙酰度越大，螯合能力越強。同時如果茶湯pH高于蛋白質等電點，蛋白質帶負電荷，殼聚糖和蛋白質能通過靜電作用聯結。

　　通常情況下將殼聚糖溶于乙酸溶液中，但乙酸的加入影響了綠茶茶湯風味，因此將殼聚糖溶于5%檸檬酸溶液中。殼聚糖澄清茶湯*佳pH 為5.5，可以從蛋白質和濁度曲線觀察出綠茶茶湯中蛋白質的等電點在pH 4-4.5，因為在pH 4-4.5 時澄清效果是很明顯的，且當茶湯pH 超過等電點時，茶湯中明顯出現大量絮狀物。茶湯中影響滋味的物質如茶多酚、游離氨基酸同樣被降低了，但降低幅度不如蛋白質顯著。pH 4.5-6 差異并不是很顯著，但pH 5.5 更接近天然泡制綠茶的pH，故選取此值。該結果與文獻報道殼聚糖在pH 5.6 能有效與果膠形成交聯網狀結構相吻合。對于綠茶茶湯不能完全追求澄清效果，因為酚類物質的降低將引起副作用，同時喪失茶原有風味。有文獻報道殼聚糖對于多酚類物質具有良好的吸附性，所以此法應進行進一步研究。

　　當殼聚糖添加量超過0.04%時，蛋白質和游離氨基酸含量隨之降低，但茶多酚含量稍微增加，這可能是由于茶多酚和殼聚糖競爭性吸附果膠和蛋白質，導致原先吸附的茶多酚被釋放出來。如果加入大量殼聚糖，殼聚糖將可能不完全溶于綠茶茶湯中，并導致茶湯澄清度降低，因此*適添加量為0.04%，并且繼續添加殼聚糖其澄清度并未顯著增加。

　　綠茶茶湯中殼聚糖提供活性吸附位點的飽和度為0.50 g/L，在添加范圍內，增加殼聚糖添加量并沒有除去更多的蛋白質和渾濁活性物質。

　　殼聚糖的處理時間未顯著影響茶湯組分，但使茶湯澄清度達到平衡。因此20 min 為*適處理時間。

　　綜上，殼聚糖澄清綠茶飲料的*佳處理條件為：pH 5.5、添加量0.04%、處理時間20 min。

　　2.3 硅膠處理硅膠
　　因能除去渾濁活性蛋白質，通常應用于啤酒和白酒的澄清穩定。硅膠的分子結構與多酚非常相似，能與渾濁活性蛋白質通過脯氨酸、羥脯氨酸位點專一、快速地相聯結。

　　在綠茶茶湯中，幾個渾濁活性茶多酚聯結到一個渾濁活性蛋白質分子上，或者幾個渾濁活性蛋白質分子聯結到一個渾濁活性茶多酚上，這取決于渾濁活性蛋白質分子中的脯氨酸含量及綠茶茶湯中蛋白質/茶多酚的比例。經硅膠澄清處理的綠茶茶湯中蛋白質含量并未顯著改變，因為綠茶茶湯中的茶多酚含量很高，大多數蛋白質，特別是渾濁活性蛋白質的活性位點被茶多酚占據，而硅膠很難與其聯結。

　　硅膠吸附蛋白質不僅與氫鍵和構型相關，同樣也與蛋白質所帶正電荷的多少相關。殼聚糖澄清試驗得到了綠茶茶湯中蛋白質等電點為pH 4-4.5。蛋白質所帶正電荷越多，硅膠和蛋白質分子之間的聯結作用越強。當茶湯pH 低于等電點時，茶湯中的蛋白質在pH 2-4 時含量明顯低于pH 4.5-6，并且茶多酚和游離氨基酸含量與蛋白質的變化趨勢一致，而澄清度則正好相反。茶多酚含量在pH 2 時為102.94 mg/100 mL，pH 3 時為117.42 mg/100mL，但是當pH 增加到6 時，茶多酚含量也明顯地增加到133.86 mg/100 mL，表明渾濁活性蛋白含量可以通過降低處理pH 而盡量地減少?？紤]到pH 2 時，綠茶茶湯中茶多酚降低太多，因此處理pH 不能過低，以免茶多酚的減少影響茶湯的風味與營養價值。

　　蛋白質和茶多酚的聚合物含量取決于綠茶茶湯中蛋白質/茶多酚比例，因此，硅膠添加量影響茶湯的澄清度。硅膠并沒有顯著影響游離氨基酸和蛋白質的含量，但影響了茶湯中茶多酚含量及茶湯初始澄清度。這種現象主要是由于硅膠特征性吸附渾濁活性蛋白質，而對于正常蛋白質（不含脯氨酸或羥脯氨酸）吸附較少。蛋白質的變化范圍為10.24-7.91mg/100 mL，從氨基酸分析中可以判斷出硅膠處理顯著地降低渾濁活性蛋白質。游離氨基酸含量變化范圍為26.50-25.67 mg/100mL，茶多酚含量變化范圍為129.95-122.12mg/100 mL，因此綠茶飲料營養價值并沒有受到影響。

　　硅膠澄清時間對于綠茶茶湯組分和澄清度的影響很微弱，因此硅膠澄清時間可縮短至20 min。

　　2.4 氨基酸分析
　　多酚對含有脯氨酸或羥脯氨酸蛋白質具有高度親和性，蛋白質“起渾性”很大程度上取決于脯氨酸或羥脯氨酸含量，并且脯氨酸或羥脯氨酸為蛋白質和多酚的結合位點。

　　茶氨酸是天然綠茶飲料中主要的游離氨基酸，對于綠茶茶湯鮮味起著很大作用。綠茶飲料的澄清處理并沒有顯著影響到茶氨酸的含量，但組氨酸和脯氨酸顯著降低，因此可以推斷脯氨酸和組氨酸是導致綠茶茶湯中茶乳酪形成的主要原因，它們可能是茶多酚的結合位點。當添加殼聚糖和硅膠到綠茶茶湯中，濁度迅速降低，并且在4℃下長時間保持澄清透明。在硅膠和殼聚糖澄清處理條件下，脯氨酸分別減少18.65 % 和23.79%，組氨酸分別減少90.97%和90.31%。大多數文獻報道脯氨酸為多酚與蛋白質結合位點，然而本實驗表明組氨酸也有可能影響到蛋白質和多酚的結合，這需要進一步研究來闡明組氨酸和茶乳酪之間的關系。

　　2.5 色澤分析
　　硅膠和殼聚糖能吸附綠茶茶湯中與顏色相關色素如：葉綠素、茶黃素、茶紅素、茶褐素。葉綠素為綠色、茶黃素為黃色、茶紅素和茶褐素為紅色。與原茶茶湯顏色相比，硅膠和殼聚糖處理后的茶湯綠色和黃色均降低，殼聚糖處理茶湯湯色*淺，通過澄清處理，△a從-2.97 增加到-1.78，△b 從24.14 降為12.85，表明葉綠素和茶黃素被吸附劑吸附，同時茶湯的亮度也增加，這與綠茶茶湯組分如蛋白質、果膠和多糖有一定的關系。　　3 結論
　　本文研究結果表明硅膠和殼聚糖能有效地通過氫鍵和靜電吸附作用澄清綠茶茶湯，但超濾并不能有效地澄清綠茶茶湯。盡管其能同時降低蛋白質和茶多酚含量，但經超濾的茶湯只能保持在初始階段澄清，低溫儲藏一周后即變渾濁。采用不同澄清方法得到的結果表明茶飲料處理過程中如不采取特殊處理方法，茶乳酪并不能有效地消除，而澄清吸附劑處理是防止渾濁產生的有效手段。殼聚糖和硅膠的復配或者復合物的制備及其與酶法相結合澄清綠茶茶湯的處理方法，可以在不破壞綠茶茶湯風味的前提下，有效抑制茶湯的渾濁，值得進一步的研究。