Western Blot實(shí)驗(yàn)中濾紙及膜的選擇
1、NC膜、PVDF膜、尼龍膜怎樣鑒別？
解答：尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類(lèi)型；硝酸纖維素（NC）膜是目前應(yīng)用*廣的一種固相支持物，價(jià)格*便宜；PVDF膜介于二者之間。
就結(jié)合能力而言：尼龍膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)480－600μg/cm2，可結(jié)合短至10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)80－100μg/cm2，對(duì)于200bp的核酸片段結(jié)合能力不強(qiáng)；PVDF膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)125－300μg/cm2。
就溫度適應(yīng)性而言：尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線(xiàn)照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結(jié)合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合DNA，結(jié)合不牢固；PVDF膜結(jié)合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。
就韌性而言：尼龍膜較強(qiáng)；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；PVDF膜較強(qiáng)。
就重復(fù)性而言：尼龍膜可反復(fù)用于分子雜交，雜交后探針?lè)肿涌山?jīng)堿變性被洗脫下來(lái)；硝酸纖維素膜不能重復(fù)使用；PVDF膜可以重復(fù)使用。
2、在做Western Blot時(shí)，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。
3、檢測(cè)磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一張膜上嗎？
解答：可以。
4、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大分子蛋白的一端（即點(diǎn)樣的一側(cè)）的轉(zhuǎn)膜不是很好？
解答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢，延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流，大分子一端就會(huì)好的多，但是小分子的就有可能會(huì)變淡。
5、膜一般要如何處理？
解答：一般用甲醇泡泡就可以了。
6、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到*佳效果。
解答：無(wú)要求。
7、跑電泳的時(shí)候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對(duì)嗎？
解答：沒(méi)什么問(wèn)題，就是膠里的水分被蒸發(fā)了。過(guò)夜時(shí)拿保鮮膜包起來(lái)，在里面加點(diǎn)水保持濕度就可以了。如果過(guò)夜，膠里的水分被蒸發(fā)，采用保鮮膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問(wèn)題，可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑，避免找麻煩。脫色液中甲醇的含量太高也會(huì)造成膠縮。
8、膜、濾紙、膠大小有何講究？
解答：如果是用的是半干轉(zhuǎn)，順序?yàn)椋宏帢O－濾紙－膠－膜－濾紙。濾紙的長(zhǎng)寬比膠的長(zhǎng)寬小1－2mm，而膜的長(zhǎng)寬分別比膠的長(zhǎng)寬大1－2mm。**禁忌：上下兩層濾紙因?yàn)檫^(guò)大而相互接觸，這樣會(huì)短路，電流不會(huì)通過(guò)膠和濾紙。
9、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？
解答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12％SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)36V，3－5hrs就可以了， 可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)；170kd 用7%SDS－PAGE， 48V 10hrs－16hrs。
10、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？
解答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）(優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》)，因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用上等的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至6％。太大時(shí)還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓／電流；增加轉(zhuǎn)移時(shí)間。
11、如何選擇*合適的蛋白雜交膜？
解答：蛋白質(zhì)印跡雜交是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中極為常用的一門(mén)技術(shù)。選擇質(zhì)量上層、合乎要求、方便適用的雜交膜是決定這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)成敗的重要環(huán)節(jié)。根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我們要量體裁衣，從雜交膜的材質(zhì)、孔徑和規(guī)格上都要做出合理的選擇。
硝酸纖維素膜：硝酸纖維素膜是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物。在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會(huì)與硝酸纖維素膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，雖然這其中的機(jī)制還不是十分清楚，但由于硝酸纖維素膜的這個(gè)特性，而且易于封閉非特異性結(jié)合，從而得到了廣泛的應(yīng)用。在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來(lái)。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，要選擇不同孔徑的硝酸纖維素膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。但是膜孔徑如果小于0.1μm，蛋白的轉(zhuǎn)移就很難進(jìn)行了。因此，我們通常用0.45μm和0.2μm兩種規(guī)格的硝酸纖維素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用0.45μm的膜就會(huì)發(fā)生“Blowthroμgh”的現(xiàn)象。從膜的質(zhì)地上來(lái)看，*重要的指標(biāo)就是單位面積上能夠結(jié)合的蛋白的量。硝酸纖維素膜的結(jié)合能力主要與膜的硝酸纖維素的純度有關(guān)，市場(chǎng)上有些硝酸纖維素膜通常會(huì)有大量的醋酸纖維素，因而降低了蛋白的結(jié)合量。S&S公司采用的是100%純度的硝酸纖維素，保證了*大的蛋白結(jié)合量，可達(dá)80-150μg/cm2。由于100%的純度，因而也大大減少了非特異性的結(jié)合，降低雜交背景，無(wú)需高嚴(yán)謹(jǐn)度的洗脫步驟。其次，膜的強(qiáng)度和韌性也是需要考慮的因素。常規(guī)的硝酸纖維素膜比較脆，漂洗一兩次就會(huì)破損，不能反復(fù)使用。
PVDF轉(zhuǎn)移膜：PVDF是一種高強(qiáng)度、耐腐蝕的物質(zhì)，通常是用來(lái)制造水管的。PVDF膜可以結(jié)合蛋白質(zhì)，而且可以分離小片段的蛋白質(zhì)，*初是將它用于蛋白質(zhì)的序列測(cè)定，因?yàn)橄跛崂w維素膜在Edman試劑中會(huì)降解，所以就尋找了PVDF作為替代品，雖然PVDF膜結(jié)合蛋白的效率沒(méi)有硝酸纖維素膜高，但由于它的穩(wěn)定、耐腐蝕使它成為蛋白測(cè)序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜與硝酸纖維素膜一樣，可以進(jìn)行各種染色和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，也有很廣的適用范圍。這種PVDF膜，靈敏度、分辨率和蛋白親和力在精細(xì)工藝下比常規(guī)的膜都要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測(cè)。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇進(jìn)行浸泡飽和1-5秒鐘。
離子交換型轉(zhuǎn)移膜：硝酸纖維素和PVDF膜是靠疏水作用結(jié)合蛋白的，還有一類(lèi)膜是根據(jù)離子交換的方式結(jié)合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修飾的纖維素制成的DEAE陰離子交換膜同樣可以 作為蛋白質(zhì)印跡的固相支持物。DEAE可以有效的結(jié)合陰離子基團(tuán)，包括那些高于其等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)。在pH10以下，DEAE基團(tuán)都能帶電荷，在低離子強(qiáng)度的轉(zhuǎn)移液中結(jié)合蛋白分子。其*適的pH環(huán)境為5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血紅蛋白的研究。這種0.45μm孔徑的DEAE膜，除了可以做Western Blotting外，還可以用于核酸結(jié)合研究。
還有一種離子交換型膜是羧甲基（CM）修飾的纖維素膜，它可以結(jié)合蛋白和多肽分子，以及其他的一些帶正電荷的樣品，*適結(jié)合pH范圍在4-7。結(jié)合的多肽分子可以從CM膜上洗脫下來(lái)，用于氨基酸系列分析或微測(cè)序。